Sursa de finantare UEFISCDI, Programul PN II-PCCA

Cod proiect PN-II-PT-PCCA-2013-4-0842

Nr. Contract 105/2014

Titlu proiect Tehnologie "verde" pentru producerea monoterpenoidelor fenolice natural identice folosite în parfumerie şi ca intermediari în industria farmaceutică

Acronim GreenTech

Descrierea proiectului

GreenTech propune realizarea unei tehnologii eco-eficiente pentru producerea a doi precursori importanţi în industria farmaceutică şi a parfumeriei, anume timolul şi carvacrolul. Tehnologia propusă mimează procesul de sinteză din natură al acestor compuşi bazându-se pe conversia biocatalitică a terpenoidelor (ɤ-terpinen şi p-cimen). Procesul de bază este o oxidare biocatalitică regio-selectivă a terpenoidelor (ɤ-terpinen si p-cimen) asistată de enzima citocrom P450 monooxigenază conducând în final la obţinerea selectivă a timolului sau a carvacrolului în funcţie de selectivitatea biocatalizatorului enzimă. GreenTech propune dezvoltarea, optimizarea şi extinderea la scară industrială a procesului biocatalitic adus în discuţie. In momentul actual, tehnologia industrială de producere a timolului şi a carvacrolului are nenumărate aspecte negative începând cu condiţiile de reacţie (temperaturi şi presiuni ridicate), continuând cu utilizarea sursei fosile de cărbune pentru generarea substratului (m-/o-crezol şi derivaţi de hidrocarbură C3) şi încheind cu o slabă performanţă catalitică ce implică un randament scăzut şi utilizarea ineficientă a materiei prime. Astfel, tehnologia în uz afectează mediul înconjurator şi mai departe calitatea vieţii. In acest sens, GreenTech lansează idea unei alternative tehnologice ”curate” bazată pe o ”chimie verde”. GreenTech este conceput pe baza conceptului de Alternativă. Astfel, în cadrul proiectului GreenTech se propune producerea timolului şi a carvacrolului direct din plante (plante din familiile Lamiaceae şi Apiaceae) alături de soluţia biocatalitică. Se va realiza extracţia din seminţe sau piroliza frunzelor generând uleiuri volatile bogate în timol (Thymus vulgaris din familia Lamiaceae) sau carvacrol (Carum carvi din familia Apiaceae). Pe lângă compuşii de bază (timol şi carvacrol), uleiurile esenţiale obţinute vor conţine şi terpenoide (ɤ-terpinen şi p-cimen) care mai departe vor constitui substrat pentru sinteza biocatalitică propusă de proiectul GreenTech. Astfel, un nou aspect ”verde” al proiectului GreenTech îl constitue utilizarea materiei prime de natură biomasică (vegetală) pentru procesul biocatalitic. De asemenea, GreenTech propune optimizarea procesului catalitic convenţional de sinteză pentru timol şi carvacrol (alchilarea m-/o-crezolului cu derivaţi de hidrocarbură C3) ca metodă de referinţă.

Pe lângă obiectivele ştiintifice specifice, proiectul GreenTech oferă un cadru adecvat dezvoltării activităţilor de cercetare propuse asigurat de o structură echilibrată a consorţiului. Astfel, GreenTech va permite realizarea obiectivelor de ordin general caracteristice proiectelor de tip parteneriat, printre care se numără îmbunătăţirea relaţiilor de parteneriat între mediul privat şi cel public în domeniul cercetării, realizarea unui feed-back pentru cercetarea fundamentală în cadrul vieţii industriale şi încadrarea cercetării româneşti la nivel internaţional. Reuşita proiectului GreenTech se bazează, de asemenea, pe faptul că acest proiect a fost generat ca o soluţie cerută de mediul privat (partenerul IMM a solicitat o tehnologie alternativă pentru sinteza timolului şi a carvacrolului care să se supună regulilor Chimiei Verzi). Produsele finale ale acestui proiect vor constitui elemente de interes pentru industria tehnologică din domeniul farmaceutic şi al parfumeriei (ex. timol, carvacrol, ulei esenţial, bioportofoliu plante cu conţinut de timol/carvacrol, tehnologie biocatalitică şi metodologie aferentă). Aceeaşi structură bine-aleasă a consorţiului va permite realizarea unei actvităţi de cercetare pe baza colaborării între mediul academic şi cel industrial, oferind o şansă în consolidarea relaţiilor industrie-universitate. Toate aceste aspecte au menirea să asigure realizarea obiectivelor ştiinţifice propuse şi implicit, succesul proiectului GreenTech în lumea industriei.

Echipa de cercetare

Etapa 2014

Rezumatul raportului de activitate

Etapa 2014 a constituit o rampa de lansare a proiectului GreenTech, cronologic fiind prima etapa de desfasurare a proiectului. In cadrul acestei etape s-a urmarit determinarea continutului de monoterpene de interes (timol, carvacrol, γ-terpinen si p-cimen) din probe de biomasa diverse. Au fost recoltate plante pentru care se cunoaste, din literatura, continutul aproximativ de monoterpene de interes. Extractia cu solvent a permis separarea compusilor de interes din biomasa. Probele rezultate au fost analizate cu ajutorul metodelor GC-FID si HPLC-DAD pentru a determina compozitia in compusi de interes (timol, carvacrol, γ-terpinen si p-cimen). S-a evidentiat biomasa provenita din specia Thymus vulgaris cu un continut de 41 % timol si 32 % p-cimen. Totodata, specia Thymus pulegioides a prezentat un continut dominant in carvacrol (53 %).

Un alt aspect urmarit in cadrul acestei etape a constat in punerea la punct a unei metode de sinteza catalitia conventionala a timolului si carvacrolului. In aceasta directie, s-a urmarit testarea unui numar mare de catalizatori cu proprietati acide care pot cataliza procesul de alchilare. Reactia chimica s-a bazat pe interactia o-/m-crezolului cu alcoolul izopropilic. Analiza produsilor de reactie s-a realizat prin metode GC-MS si GC-FID. Sistemul catalitic optimizat implica utilizarea catalizatorului Nafion SAC 13/ GO-SO3CF pentru a obtine un maxim de conversie de 32 % si 22 % si cu o selectivitate maxima de 100 % pentru timol si doar 22 % pentru carvacrol.

Rezultate obtinute

In cadrul etapei 2014 s-a stabilit ca specia Thymus vulgaris sa fie sursa de biomasa pentru extractia uleiului volatil. Aceasta planta are un continut mare de monoterpene de interes (41 % timol si 32 % p-cimen). Specia Thymus pulegioides este o sursa naturala de carvacrol (53 % carvacrol).

Studiul procesului de sinteza catalitica (alchilare) a permis alegerea catalizatorilor Nafion SAC 13 si GO-SO3CF3 drept catalizatori optimi pentru sinteza timolului/carvacrolului.

Web-site-ul proiectului a fost construit si informatiile corespunzatoare au fost publicate.

Publicatie
M. Tudorache, S. Coman, V.I. Parvulescu, Cap. 1 „Catalytic metal-/bio-composites regarding as new opportunities for fine chemical derived from biomass”, titlul cartii Advanced Catalytic Materials, ed. Wiley, 2014.

Diseminare
1. 4th International Conference on Novel Enzyme, octombrie, Ghent, Belgia (prezentare orala).
2. Conferinta Nationala de Chimie, octombrie, Calimanesti, Romania (poster).

Etapa 2015

Rezumatul raportului de activitate

Etapa II/2015 a implicat obtinerea un sistem biocatalitic pentru sinteza carvacrolului, usor adaptabil in sinteza timolului. Sistemul biocatalitic a fost testat atat pentru biocatalizatori omogeni cat si pentru cei heterogeni. Biocatalizatorii heterogeni au prezentat o usoara scadere a activitatii catalitice comparativ cu cei omogeni. Totusi, avantajele reutilizarii lor ii impun pe acestia din urma ca solutii viabile pentru sistemul biocatalitic propus. Totodata, au fost testate variante diferite ale sistemului catalitic de sinteza. Acestea au inclus forma clasica si cea neconventionala pentru alchilarea derivatilor fenolici cu scopul de a obtine timol si carvacrol. Testarea uleiurilor extrase din plantele de interes, a constituit un pas important in cadrul acestei etape. Rezultatele obtinute demonstreaza ca matricea uleiului influenteaza procesul biocatalitic. Solutia a fost utilizarea unui pre-tratament al uleiului inainte de introducerea in sistem, prin dilutia cu etanol.

S-a reuşit descrierea şi adaptarea unui protocol de izolare a fracţiei microsomale fără a fi necesară centrifugarea la viteză mare (ultracentrifugarea). Dintre metodele testate, metoda adaptată după Abas şi Luschnig din 2010 s-a dovedit a fi cea mai eficientă cu cel mai mare conţinut proteic în fracţia microsomală. Această metodă a fost adaptată la cantităţi mari de material vegetal. De asemenea, am stabilit compoziţia soluţiei tampon de resuspendare a microsomilor care să asigure păstrarea lor petru o perioadă mai mare de timp, incluzând glicerol şi care permite păstrarea fracţiei microsomale la temperaturi scăzute (-20 °C) fără formarea cristalelelor de gheaţă care pot denatura proteinele.

Diseminarea proiectului a constituit, de asemenea, o parte importanta a acestei faze. activitatea desfasurata in aceasta directie s-a concretizat in prezenta la manifestari stiintifice de profil, pregatirea si submiterea unor articole stiintifice si aducerea la zi a site-ului proiectului.

Rezultate obtinute

Activitatea de cercetare desfasurata in cadrul acestei etape a permis obtinerea rezultatelor propuse in planul de activitate. Astfel, au fost obtinute uleiurile esentiale prin extractie din sursa vegetala (ulei de cimbru, cimbrisor, fenicul, chimen si oleandru). Uleiul si extractul de cimbru au prezentat cea mai mare concentratie de ɤ-terpinen si carvacrol. Au fost preparate extractele microzomale cu continut de citocrom P450 monooxigenaza. Cele mai bune performante s-au obtinut pentru microzomii din cimbrisor. Au fost realizate sisteme omogene pentru testarea microzomilor si implicit s-a pus la punct o metoda de analiza a amestecului final de reactie, metoda bazata pe detectia GC-FID/MS. Totodata, a fost realizat si optimizat un sistem/ metoda catalitic de sinteza a timolului si carvacrolului bazat pe alchilare directa a crezolilor cu izopropanol.

Rezultatele activitatii de cercetare au fost structurate in 2 articole in jurnale ISI, 2 prezentare orala si 4 postere. Toate acestea sunt prezentate in cadrul raportului de faza. Faptul ca rezultatele acestei faze fac obiectul unor comunicari stiintifice sub forma de prezentari si articole, demonstreaza inca o data reusita activitatii experimentale desfasurata in etapa II/2015.

Publicatii

1. Madalina Tudorache, Andreea Gheorghe and Vasile I. Parvulescu, Tetrahedron, in curs de revizuire, 2015.

2. Florina Teodorescu, Simona Nica, Cornelia Uncuta, Emeric Bartha, Petru Ivan Filip, Nicolas Vanthuyne, Christian Roussel, Attila Mándi, László Tóth, Tibor Kurtán, Jean-Valère Naubron, Isabela-Costinela Man, Tetrahedron: Asymmetry, 26 (2015) 1043-1049.

Diseminare

1. 3th North and East European NEEFOOD Congress, 20-23 May 2015, Brasov, Romania (prezentare orala).

2. 3th International conference Catalysis for renewable sources: fuel, energy, chemicals, September 6-10 2015, Sicilia, Italia (prezentare orala si M. Tudorache-chairperson).

3. BioTrans 2015, Vienna, Austria, July 26-30, 2015 (poster).

4. 12th European Congree on Catalysis - EuropaCat-XII, Kazan, Russian, 30 August - 4 September, 2015 (poster).

5. 19th Romanian International Conference on Chemistry and Chemical engineering, Sibiu, Romania, September 2-5, 2015 (poster).

6. 19th Romanian International Conference on Chemistry and Chemical engineering, Sibiu, Romania, September 2-5, 2015 (poster).

Etapa 2016

Rezumatul raportului de activitate

In cadrul etapei 2016 a fost optimizat sistemul biocatalitic pentru derivatizarea γ-terpinenului la compusi hidroxilici (ex. timol si carvacrol). A fost desfasurata o activitate experimentala pentru testarea si evaluarea uleiurilor volatile cu continut de γ-terpinenului si p-cimen provenind din surse naturale diferite (chimen, cimbru si cimbrisor). Totodata, a fost pus in evidenta efectul de matrice existent cu preponderenta la cimbrisor. Cimbrul a constituit sursa cea mai buna de ulei volatil.

Genenele codificatoare de citocrom P450 de la M.spicata sşi T.vulgaris au fost clonate si subclonate in vectori de exprimare in celulela gazda de S.cerevisiae. Secventa genei de la menta a fost identica cu cea din bazele de date si desi cea de la cimbrisor prezinta niste diferente, acestea s-ar putea sa nu influenteze activitatea enzimatica.

Tot in cadrul acestei etape a fost testata modalitatea de imobilizare a enzimei pe suport solid sau in matrice bio-polimerica. S-a preferat ca model oxidarea α-pinenului cu ajutorul lipazei pentru a oferi experienta de lucru echipei de cercetare si a permite stabilirea metodei de imobilizare in conditii economicoase.

In cadrul acestei etape a fost realizata instalatia pilot pentru sinteza timolului si carvacrolului pe principii catalitice. Optimizarea acestei instalatii a inceput in cadrul acestei etape, urmand a fi definitivata in etapa urmatoare. De asemenea, aceeasi instalatie pilot este aplicabila sistemului biocatalitic de hidroxi-derivare a γ-terpinenului/ p-cimenului.

Rezultate obtinute

Activitatea de cercetare desfasurata in cadrul acestei etape a permis obtinerea rezultatelor propuse in planul de activitate. Astfel, a fost realizat sistemul biocatalitic pentru derivatizarea γ-terpinenului si p-cimen, a fost stabilita sursa de materie prima optima ca fiind cimbrul si s-au pus bazele instalatiei pilot pentru producerea catalitica a timolului si carvacrolului.

Rezultatele activitatii de cercetare au fost structurate in 3 articole in jurnale ISI si prezentate in cadrul a 8 manifestari stiintifice sub forma a 4 prezentari orala si 4 postere. Toate aceste aspecte sunt detaliate in cadrul raportului de faza.

Publicatii

1. M. Tudorache, A. Gheorghe, A. Negoi, M. Enache, G.-M. Maria, V.I. Parvulescu - "Bifunctional carbohydrate biopolymers entrapped lipase as catalyst for the two consecutive conversions of α-pinene to oxy-derivatives", Carbohydrates Polymers, 2016, 152, 726-733.

2. M. Tudorache, A. Gheorghe, A.S. Viana, V.I. Parvulescu - "Biocatalytic epoxidation of α-pinene to oxy-derivatives over cross-linked lipase aggregates", J. Molec. cat. B: Enzymatic, 2016, 134(A), 9-15.

3. F. Teodorescu, A. Enache, M. Sandulescu - " Selective alkylation of m-cresol with isopropyl alcohol under solvent-free conditions", article submitted for publication in Arkivoc journal.

Diseminare

1. Biocat, Hamburg, Germane, 29 August - 1 September, 2016. (Lithning talk)

2. International Conference on Green Chemistry and Sustainable Engineering, Rome, Italy, 20-22 July, 2016. (prezentare orala)

3. ICC, Beijing, China, 3-8 July, 2016. (poster)

4. IUPAC Green Chemistry, Venice, Italy, 4-8 September, 2016. (prezentare orala)

5. NovoZyme, Groningen, Netherland, 11-14 October, 2016. (poster)

6. 11th International Symposium of the Romanian Catalysis Society, Timisoara, Romania, 6-8 June, 2016. (prezentare orala)

7. a XXXIV-a Conferinta Nationala de Chimie, Calimanesti-Caciulata, Romania, 4-7 oct, 2016. (poster)

8. Al 8-lea Congres National cu participare internationala si a 34-a sesiune stiintifica anuala a Societatii Romane de Biologie Celulara, Cluj-Napoca, Romania. (poster)

Etapa 2017

Rezumatul raportului de activitate

In cadrul acestei etape s-a urmarit modelarea si ridicarea la scara pilot a proceselor de sinteza a monoterpenelor de interes (timol si carvacrol). Testarea sistemelor biocatalitice a fost realizata cu monoterpenele de interes (p-cimen si γ-terpinene).

Au fost pusa in aplicare schema tehnologica pentru purificarea enzimei P450. Enzima a constituit biocatalizatorul in sistemul biocatalitic realizat la scala pilot. Instalatia corespunzatoare purificarii enzimei a fost optimizata si testata in vederea producerii enzimei purificate.

A fost optimizata si testata instalatia pilot care sa permita sinteza biocatalitica a timolului si carvacrolului. Produsele finale obtinute au fost timol si carvacrol.

Originalitatea si succesul acestei etape sunt evidentiate in cadrul activitatii de diseminare prin participarea la conferinte stiintifice avand tematici de interes comun cu proiectul GreenTech si prin publicarea sub forma de articole stiintifice a rezultatelor obtinute.

Rezultate obtinute

Au fost realizate toate activitatile propuse in planul de realizare. A fost optimizata si testata instalatia pilot de obtinere biocatalitica a timolului si carvacrolului.

Transformarea biocatalitică a p-cimenului la carvacrol a fost examinată pe baza hidroxilării regio-selective catalizată de monooxigenaza citocromului P450. Carvacrolul a fost produs cu 20 % randament pentru o conversie de 62 % de p-cimen. De asemenea, a fost stabilită o alternativă pentru sinteza timolului cu un randament de 10 % în timol pentru 52 % conversie a p-cimenului.

In cadrul acestei etape s-a realizat un proces amplu de diseminare a rezultatelor. Astfel, membrii echipelor de cercetare au participat la 6 evenimente de specialitate (conferinte). Au fost construite 4 manuscrise pe baza datelor experimentale ontinute (1 articol se gaseste in press si celelalte sunt trimise spre publicare/ proces de evaluare).

Publicatii

1. Iulia Lupan, Rahaela, Carpa, Andreea Olteanu, Beatrice Simona Kelemen, Octavian Popescu, Microbes and Environments, 2007 in press (doi:10.1264/jsme2.ME17016).

2. Daniela Gheorghe, Ana neacsu, Iulia Contineanu, Elena M Anghel, Florina Teodorescu, Irina E Chican, Stefan perisanu, Speranta Tanasescu, Journal of Chemical Thermodynamics, manuscris trimis spre publicare (JCT-17-73R3).

3. Simona Reznicencu, Alina, Negoi, Madalina Tudorache, Nina, Beyer, Dick Janssen, Vasile Parvulescu, Green Chemistry, manuscris trimis spre publicare (GC-ART-06-2017-001793).

Diseminare

1. M. Tudorache, A. Negoi, A. gheorghe, M. Enache, G.-M. Maria, A. Viana, V.I. Parvulescu, How to produce flavors and fragrances from α-pinene - design the lipase-based catalyst for selective biocatalytic oxidation of α-pinene , Chemical reactions in foods VIII, Praga, Cehia, februarie 2017. (prezentare orala)

2. S. Reznicencu, A. Negoi, M. Tudorache, V.I. Parvulescu, Biocatalytic synthesis of thymol/carvacrol from γ-terpinene and p-cymene, 14th International Conference "Students for Students", Cluj-Napoca, Romania, aprilie 2017. (poster)

3. M. Tudorache, A. Negoi, A. Gheorghe, M. Enache, G.-M. Maria, A. Viana, V.I. Parvulescu, Green alternative for the valorization of the terpenoidic fraction of turpentine - biocatalytic conversion of α-pinene into value-added products, International Symposium in Green Chemistry, La Rochelle, Franta, mai 2017. (poster)

4. M. Tudorache, A. Negoi, A. Gheorghe, M. Enache, G.-M. Maria, A. Viana, V.I. Parvulescu, Design of the enzyme-catalyst "affecting" the transformation of α-pinene from turpentine into flavors and fragrances, North American Catalysis Society meeting, Denver, USA, iunie 2017. (poster)

5. M. Tudorache, A. Negoi, A. Gheorghe, M. Enache, G.-M. Maria, A. Viana, V.I. Parvulescu, Valorization of α-pinene from turpentine - biocatalytic conversion of α-pinene into flavours and fragrances, 13th International Conference on Renewable Resources and Biorefineries, Wroklaw, Polonia, iunie-mai 2017. (poster)

6. F. Teodorescu, A. Enache, M. Sandulescu, Selective alkylation of m-cresol with isopropyl alcohol under solvent-free conditions, 2nd Green and Sustainable Chemistry Conference 2017, 14-17 mai 2017 în Berlin, Germania. (poster)